产品货号：
YTB3015
中文名称：
cDNA第一链合成试剂盒
英文名称：
BalbRT Q First Strand cDNA Synthesis Kit
产品规格：
20T|100T|500T
发货周期：
1～3天
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本制品是一种采用了经过改造和优化特别适合定量PCR(qPCR)的高精确度的BalbRT Q M-MLV反转录酶，可以用于以总RNA、mRNA等为模板反转录合成cDNA第一链的试剂盒。本试剂盒包含了进行cDNA第一链合成所需的各种试剂。
本试剂盒提供了RNase Inhibitor，确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得良好的反转录效果。本试剂盒还提供了Oligo(dT)18和random hexamer这两种引物，前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录，后者适合用于任何RNA的反转录。也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA第一链的合成。
使用本试剂盒合成的第一链，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR也称定量PCR(qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建，尤其是逆转录所得目的基因的克隆等。
本试剂盒中使用的BalbRT Q M-MLV反转录酶是最常用的优质反转录酶之一，广泛用于获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成，特别适合用于qPCR和一步法的qRT-PCR，本制品的反转录产物也适合用于常规的PCR、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建，以及逆转录所得目的基因的克隆等。
80℃孵育10min可以导致本制品中的BalbRT Q M-MLV反转录酶失活；EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对BalbRT Q M-MLV反转录酶有抑制作用。
| 组分 | 20T | 100T | 500T |
| BalbRT Q M-MLV反转录酶 | 20μL | 100μL | 500μL |
| 5×Reaction Buffer | 0.1mL | 0.5mL | 2.5mL |
| RNase Inhibitor (20U/μL) | 20μL | 100μL | 500μL |
| dNTP Mix (10mM each) | 40μL | 200μL | 1mL |
| Oligo(dT)18 Primer (0.5μg/μL) | 20μL | 100μL | 500μL |
| Random Hexamer Primer (0.2μg/μL) | 20μL | 100μL | 500μL |
| DEPC-treated Water | 0.3mL | 1.5mL | 7.5mL |
保存：-20℃
1.使用BalbRT Q M-MLV反转录酶对总RNA进行反转录，之后以不同稀释倍数的cDNA为模板，通过qPCR检测目的基因的结果请参考图1。
图1.BalbRT Q M-MLV反转录酶对总RNA进行反转录后用于qPCR检测的效果图。从HEK293T细胞抽提获得的总RNA 2μg，在20μL反转录体系中进行反转录，反转录后取1μL (100%)或不同稀释比例(1μL的10%、1%、0.1%、0.01%)反转录产物进行GAPDH cDNA 151bp目的片段的qPCR扩增和电泳检测。A.扩增曲线图。B.溶解曲线图。C.qPCR扩增产物的电泳图。NTC (no-template control)，用水代替反转录产物。qPCR反应体系20μL，使用荧光定量PCR反应预混液(SYBR Green I)。实际检测效果会和特定实验条件有关，图中结果仅供参考。
2.使用本试剂盒也可以轻松完成长度为8kb以下基因的反转录(参考图2)，反转录的最大长度可以达到12kb。
图2.使用本试剂盒对总RNA反转录后，对于不同长度的cDNA进行PCR扩增后的电泳效果图。图中可见对于0.2～12kb的cDNA可以非常高效地被反转录。实际反转录特定目的基因片段后，PCR扩增较大片段时可能需要适当优化引物和PCR扩增条件，图中的扩增效果仅供参考。
- cDNA第一条链的合成(First-stand cDNA Synthesis)。
- 参考如下表格中设置的20μL反转录体系(RNase抑制剂和25mM dNTP混合液可从百奥莱博订购)：
成分 用量 模板(右侧3种任选其中一种) Total RNA 0.1ng～5μg 或poly(A) RNA/mRNA 10pg～0.5μg 或specific RNA 0.01pg～0.5μg 引物(右侧3种任选其中一种) Oligo(dT)18 primer 1μL 或Random Hexamer primer 1μL 或gene-specific primer 15～25pmol DEPC-treated Water 至12μL 选择性步骤：如果模板RNA的GC含量较高(例如大于55%)或者有比较严重的二级结构，混匀后微离心以把液体沉降至管底，65℃孵育5min，随后立即置于冰上冷却，以打开RNA中一些比较稳定的二级结构。 5×Reaction Buffer 4μL RNase Inhibitor(20U/μL) 1μL dNTP Mix(10mM each) 2μL BalbRT QM-MLV反转录酶 1μL 总体积 20μL - 轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
- 如果使用Oligo(dT)18或基因特异性引物，42℃孵育10～60min。如果使用random hexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10min，随后在42℃孵育10～60min。反转录3kb以下的cDNA，反转录10min即可，反转录3～6kb的cDNA，反转录30min即可，而6kb以上的cDNA推荐反转录60min。当使用random hexamer(随机六聚体)作为引物，并且后续用于qPCR时，后续检测任何长度的基因，均反转录10min就足够了。
- 80℃孵育10min以失活BalbRT Q M-MLV反转录酶并终止反转录反应。说明：对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶，该方法易导致部分长片断DNA被剪切，此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
- 反转录产物可以直接用于后续的qPCR反应等，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为20和50μL，则推荐相应地使用1和2.5μL反转录产物。
- 参考如下表格中设置的20μL反转录体系(RNase抑制剂和25mM dNTP混合液可从百奥莱博订购)：
- 引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶的相关文献资料进行。
- 总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，并且总RNA的反转录产物大小很不均匀，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。 - 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
- PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
- 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0，则提示总RNA发生了显著的降解，最好能重新制备总RNA样品。避免RNA降解的主要方法是，严格进行RNA的相关操作，包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA，以尽量避免RNase污染。
- 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用百奥莱博的BalbZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
- 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增，通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
- 没有使用适当的反转录引物。对于细菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA，要用random hexamer引物代替Oligo(dT)18引物。使用基因特异性反转录引物时，需要确保基因特异性引物设计合理正确。
- PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
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